Steroid

Steroid adalah kelompok senyawa bahan alam yang kebanyakan strukturnya terdiri atas 17 atom karbon dengan membentuk struktur dasar 1,2-siklopentenoperhidrofenantren. Steroid memiliki kerangka dasar triterpena asiklik. Ciri umum steroid ialah sistem empat cincin yang tergabung. Cincin A, B, dan C beranggotakan enam atom karbon dan cincin D beranggotakan lima atom karbon.

a.    Asal usul steroid

Senyawa golongan steroid memiliki bioaktivitas yang penting, misalnya dalam pembentukan struktur membran, pembentukan hormon dan vitamin D, sebagai penolak dan penarik serangga dan sebagai anti mikroba.

Steroid yang terdapat dalam jaringan hewan berasal dari triterpenoid lanosterol sedangkan yang terdapat dalam jaringan tumbuhan berasal dari triterpenoid sikloartenol setelah triterpenoid ini mengalami serentetan perubahan tertentu. tahap-tahap awal dari biosintesa steroid adalah sama bagi semua steroid alam yaitu pengubahan asam asetat melalui asam mevalonat dan skualen (suatu triterpenoid) menjadi lanosterol dan sikloartenol. Kolesterol terbentuk dari lanosterol setelah terjadi penyingkiran tiga gugus metil dari molekul lanosterol yakni dua dari atom karbon C-4 dan satu dari C-14. Penyingkiran ketiga gugus metil ini berlangsung secara bertahap, mulai dari gugus metil pada C-14 dan selanjutnya dari C-4. Kedua gugus metil pada kedua C-4 disingkirkan sebagai karbon dioksida, setelah keduanya mengalami oksidasi menjadi gugus karboksilat. sedangkan gugus metil pada C-14 disingkirkan sebagai asam format setelah gugus metil itu mengalami oksidasi menjadi gugus aldehid.

Percobaan dengan jaringan hati hewan, menggunakan 2,3 epoksiskualen yang diberi tanda dengan isotop 180 menunjukkan bahwa isotop 180 itu digunakan untuk pembuatan lanosterol menghasilkan (180)- lanosterol radioaktif. Hasil percobaan ini membuktikan bahwa 2,3- epoksiskualen terlibat sebagai senyawa antara dalam biosintesa steroida. Molekul kolestrol terdiri atas tiga lingkar enam yang tersusun seperti fenantren dan terlebur dalam suatu lingkar lima. Hidrokarbon tetrasiklik jenuh yang mempunyai sistem lingkar demikian dan terdiri dari 17 atom karbon sering ditemukan pada banyak senyawa yang tergolong senyawa bahan alam yang disebut stroida.

b.   Struktur molekul

Steroid mempunyai struktur dasar yang terdiri dari 17 atom karbon yang membentuk tiga cincin sikloheksana dan satu cincin siklopentana. Perbedaan  jenis steroid yang satu dengan steroid yang lain terletak pada gugus fungsional yang diikat oleh ke-empat cincin ini dan tahap oksidasi tiap-tiap cincin.

c.    Skrining fitokimia/reaksi pengenalan

1.    Ekstraksi

Steroid merupakan golongan senyawa yang sebagian besar bersifat nonpolar maka ektsraksinya biasanya juga menggunakan pelarut nonpolar misalnya n-heksana atau petrelium eter. Dapat juga di gunakan pelarut etanol atau methanol terlebih dahulu sebagai pelrut universal kemudian setelah diperoleh ekstraksi partisis menggunakan pelarut nonpolar. Jika yang akan di isolasi adalah senyawa steroid yang dterikat dengan gugus gula, maka ekstraksi dilakukan dengan menggunakan pelarut semipolar atau bahkan pelarut polar tergantung pada gugus gula yang terikat. Ekstraksi juga dapat di lakukan baik dengan pemansan (soxhletasi) maupun tanpa pemanasan (maserasi) pada suhu kamar.

2.    Pemisahan

Cara KLT steroid menyerupai KLT triterpenoid. Kadang-kadang di jumpai campuran rumit beberapa steroid dalam jaringan tumbuhan tertentu dan diperlukan cara yang lebih rumit untuk memisahkannya. Misalnya Steroid, kolesterol, dan stigmasterol tidak mudah di pisahkan bila berada bersama-sama dalam sampel, tetapi ketiganya akan terpisah dengan mudah  jika di ubah menjadi bentuk asetatnya. Cara lain adalah melakukan pemisahan menggunakan HPLC preparative. Untuk memisahkan sterol umum dari turunan dihidronya (misalnya sitosterol dan sitostanol) di perlukan KLT AgNO₃. Eluen yang di pakai adalah kloroform dengan penampak noda H₂SO₄ . H₂O (1:1).

Beberapa steroid dapat di pisahkan menggunakan menggunakan kromatografi kolom atau KLTP dengan adsorben alumina dan eluen berupa campuran sikloheksana-etilasetat dan campuran metilen diklorida-aseton.

Jika dalam sampel dipastikan terdapat saponin, maka sebelum dilakukan pemisahan, ektrak yang diperoleh direaksikan terlebih dahulu dengan HCL 1 M untuk menghidrolisis saponin tersebut hingga diperoleh aglikon sapogenin. Pemisahan campuran sapogenin dilakukan denag KLTP dengan menggunakan eluen campuran aseton-n-heksana atau campuran kloroform-CCl₄-aseton. Sapogenin akan muncul sebagai noda yang berwarna kemerahan setelah pelat disemprot dengan antimony klorida dalam HCl pekat dan dipanaskan pada 110^o celcius selama 10 menit.

Jika pemishan dilakukan terhadap saponin, maka adsorben yang dipakai adalah selulosa. KLT dengan silica gel berhasil juga tapi dengan memakai eluen seperti n-butanol yang di jenuhkan dengan air atau campuran kloroform-metanol-air.

Beberapa glikosida jantung dapat dipisahkan dengan KLTP suatu arah pada silica gel dengan menggunakan eluen berupa lapian atas dari campuran etil asetat-piridin-air (1 arah) dan campuran kloroform-piridin (satu arah yang lain). Beberapa campuran senyawa yang lain dapat dipisahkan menggunakan elusi berulang pada pelat silica gel dengan eluen campuran etil asetat-metanol (elusi dua kali) atau dengan eluen campuran kloroform-metanol-formamida (elusi empat kali).

3.    Rekristalisasi

Ekstrak pekat yang di peroleh di larutkan dalam 100 ml petroleum eter. Kemudian campuran diuapkan sampai dicapai titik jenuhnya dan di biarkan selama hingga terbentuk Kristal tak berwarna yang mengendap dengan titik leleh 138-144° C.

d.   Isolasi dan pemurnian serta penentuan struktur

Untuk isolasi senyawa steroid dapat dicontohkan dengan senyawa steroid dari teripang. Dimana isolasi senyawa steroid dari teripang terdiri dari dua tahap yakni mengekstraksi bagian lemak pada teripang, kemudian dilanjutkan dengan mengekstraksi senyawa steroidnya. Berikut merupakan salah satu penelitian yang dilakukan Sarifah Nurjanah, dkk (2009) untuk mengidentifikasi steroid teripang pasir (Holothuria scabra) yang ada di Indonesia.

Ekstraksi steroid teripang dilakukan dengan dua tahap, yaitu ekstraksi lemak kemudian dilanjutkan dengan ekstraksi steroid. Ekstraksi lemak dilakukan dengan pelarut aseton dengan cara maserasi, selanjutnya dilakukan proses penyabunan dengan menggunakan larutan KOH 1 M dan dilakukan refluks pada suhu 70⁰C selama 1 jam. Steroid diekstrak dengan menggunakan pelarut dietil eter.

Identifikasi keberadaan senyawa steroid pada teripang dilakukan dengan reaksi warna menggunakan pereaksi liebermann burchard yang terdiri dari kloroform, asam asetat anhidrid dan asam sulfat pekat.

Karakterisasi senyawa steroid teripang dilakukan dengan melihat bobot molekul dan struktur molekul menggunakan liquid chromatography-mass spectroscopy (LC-MS), nuclear magnetic resonance (NMR) dan fourier transform-infra red (FT-IR). LC-MS yang digunakan adalah Mariner Biospectrometry/ Perkin Elmer Series 200 dengan sistem ESI (Electrospray Ionisation), pelarut metanol dan air dengan perbandingan 8:2 (metanol:air) dengan menggunakan kolom C18 (RP 18) Vydac. FT-IR yang digunakan adalah IR Prestige-21 FT-IR Shimadzu dengan metode diffuse reflectance (DRS). Pengukuran spektra 1H NMR dan 13C NMR menggunakan NMR JNM-ECA 500 dengan pelarut CDCl3 (kloroform-D) dan TMS (tetramethylsylane) sebagai standar internal. Penentuan senyawa dan struktur  molekul dilakukan dengan bantuan software DNP Chapman and Hall dan ChemOffice 2006.

Dari hasil isolasi tersebut, diperoleh 4 senyawa bioaktif yang merupakan steroid dominan yang ditemukan dalam jenis Holothuria scabra atau teripang pasir. Senyawa steroid tersebut yaitu :

1.      24-ethylidenecholest-25-en-ol.

Mempunyai rumus molekul C29H48O. Senyawa ini juga ditemukan pada Bathyplotes natans (teripang) dan juga terisolasi dari koral Sinularia gyrosa

2.      Lanost-9(11)-en-3-ol.

Mempunyai rumus molekul C30H52O. dikenal juga dengan sebutan Dihydroparkeol yang mempunyai efek mencegah reaksi inflamasi, infeksi bakteri, arterosklerosis, dan juga kanker.

3.      Cholestane-3,4,6,15,24-pentol atau 28-O-(4-O-Methyl-D-xylopyranoside)

Atau certonardoside H2 ini mempunyai rumus molekul C34H60O9. Senyawa ini merupakan suatu senyawa saponin, yaitu steroid yang berikatan dengan monosakarida atau disakarida. Pada senyawa ini monosakarida yang terikat adalah xylosa, senyawa ini mempunyai aktivitas sitotoksik. Senyawa certonardoside H2 ini juga ditemukan pada bintang laut Certonardoa semiregularis.

4.                    24-O-[2,4-Di-O-methyl-D-xylopyranosyl-(12)-d-xylofurinoside]

Atau disebut juga certonardoside H1 atau culcitoside ini, mempunyai rumus molekul C39H68O13. Merupakan suatu senyawa saponin, di mana pada senyawa tersebut terikat disakarida yang terdiri dari xylosa dalam bentuk furanosa dan piranosa. Culcitoside juga ditemukan pada bintang laut jenis Certonardoa semiregularis. Senyawa ini mempunyai aktivitas sitotoksik.

Dari keempat senyawa tersebut, seluruhnya merupakan steroid teripang yang terdiri atas saponin, sterol bebas, dan sterol yang berikatan dengan triterpen glikosida pada posisi atom C nomor 20. Glikosida triterpen merupakan karakteristik dari senyawa bioaktif yang dihasilkan oleh teripang. Mayoritas glikosida triterpennya merupakan type holosstane (derivat dari lanostane dengan 18(20)-lactone). Gugus gula yang terikat pada steroid teripang dapat berupa xylose, glucose, quinovose, 3-O-methylglucose, atau 3-O-methyl-xylose.

Saponin pada beberapa biota laut dilaporkan sebagai komponen antifungal dan mempunyai aktivitas mikrobial, anti tumor dan mempunyai aktivitas anti inflamasi.

Pada beberapa senyawa steroid teripang di atas juga dapat dijumpai pada spesies lain. Hal ini mungkin disebabkan adanya proses simbiosis yang terjadi pada organisme laut, yang hingga saat ini masih sukar dirunut untuk mengetahui organisme penghasil yang sesungguhnya. Meski senyawa tersebut dapat dijumpai pula dibeberapa spesies lain, tetapi kadar yang diperoleh akan mengalami perbedaan. Adanya perbedaan tersebut dapat disebabkan oleh adanya perbedaan tempat habitat yang akan menyebabkan perbedaan kandungan steroid. Ketersediaan makanan pada suatu tempat yang berbeda, perbedaan iklim dan lingkungan mempengaruhi metabolisme dalam tubuh teripang, sehingga akan mempengaruhi jenis produksi steroidnya.

e.    Bioaktivitas

Tumbuhan Algae marmelos (L.) Correa merupakan salah satu jenis tumbuhan obat yang terdapat di hutan hujan tropis Indonesia. Tumbuhan ini memiliki beberapa nama daerah seperti maja, gelepung, maja gedang, maja lumut, maja pahit, maja paek, dan maos. Berbagai hasil penelitian mengenai kandungan kimia pada tumbuhan ini telah dilaporkan. Konstituen utama dari ekstrak daun diidentifikasi sebagai tannin, skimmianin, essensial oil, sterol, triterpenoid, dan flavonoid. Hasil uji fitokimia yang telah dilakukan menunjukkan bahwa dalam kulit batang Algae marmelos mengandung senyawa golongan steroid.

Bahan yang digunakan yaitu: pelarut organik (n-heksana, metanol, kloroform), silika gel GF 254 (untuk KLT), silika gel 60 (35-70 mesh) (untuk Kromatografi kolom), perealsi Liebermann-Burchard (untuk uji steroid). Alat yang digunakan yaitu: seperangkat alat destilasi sederhana, neraca elektronik balance Chyo model MP-300, pengisat gasing hampa R 114 Buchi dilengkapi dengan sistem vacum Buchi B 169, sumber UV Iric Seisakusho tipe L5-D1, oven mermer model 600, spektrofotometer inframerah, dan spektrofotometer NMR-1H.

Serbuk kering kulit batang Algae marmelos diekstraksi dengan cara maserasi menggunakan pelarut metanol. Ekstrak metanol dipekatkan kemudian difraksinasi menggunakan n-heksana lalu diuji steroid. Uji fitokimia dengan menggunakan pereaksi Liebermann-Burchard memberikan warna hijau, menunjukkan bahwa isolat tersebut positif steroid.

Ekstrak n-heksana merupakan fraksi yang positif steroid kemudian dipisahkan dengan cara kromatografi kolom menggunakan fase diam silika gel dan dielusi (proses mengekstrasi zat yang umumnya padat dari campuran zat dengan menggunakan zat cair) secara isokratik (komposisi fase gerak tetap) menggunakan eluen (pelarut) n-heksana-kloroform (70:30).

Semua fraksi dianalisis menggunakan KLT. Fraksi yang sama digabung berdasarkan pola noda yang sama dan diuji steroid. Fraksi yang positif steroid (vial 15-22) menghasilkan kristal. Rekristalisasi dengan menggunakan metanol sampai diperoleh steroid yang murni. Uji kemurnian dilakukan dengan menggunakan KLT. Penentuan struktur molekul isolat murni dilakuakn dengan menggunakan spektofotometer inframerah dan spektrifotometer NMR-1H

Dari keseluruhan data spektrum yang diperoleh, senyawa hasil isolasi adalah senyawa steroid golongan sterol, yaitu stigmasterol. Hal ini berdasarkan spektrum NMR-1H yang mirip dengan spektrum database stigmasterol. Struktur stigmasterol adalah sebagai berikut:

PERMASALAHAN

1.    Darimana sajakah sumber steroid yang bisa kita temukan dan bagaimanakah kita dapat mengidentifikasinya bahwa sumber tersebut sungguh mengandung senyawa terpenoid?

2.    Salah satu tumbuhan yang ditemukan mengandung senyawa steroid adalah tumbuhan pepaya (Carica papaya L.), yang mengandung senyawa steroid golongan sterol (campesterol). Bagaimana cara melakukan identifikasi keberadaan senyawa steroid pada tumbuhan pepaya? Uji apa saja yang dapat dilakukan dalam kasus ini?
3.   Senyawa steroid dekat dalam kehidupan kita sehari-hari, bisa dalam bentuk apa saja? Bila dalam bentuk makanan, apakah baik untuk dikonsumsi? Apakah efek yang ditimbulkan bila mengkonsumsi atau memakai produk mengandung senyawa steroid?